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实验方法
[ 来源:未知 | 作者:admin | 时间:2019-9-8 02:01:44 ]

  1. 处死动物或获得活体解剖后,将分离的组织放在置于冰上的 100 ml 烧杯中,马上用 25 ml 核缓冲液 A 冲洗。

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  2. 将组织转移到 100 mm 塑料培养皿中,置冰上,按以下量加入核缓冲液 A: 肝,8 ml;肾,5 ml; 脾,4 ml。将组织用剃刀刀片或解剖刀切割成大小为几毫米的小块。

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  3. 将每个小块移入不同的匀浆器。对于上述大小的组织,如果是肝或肾组织,用 15 ml 的匀浆器;如果是脾组织,用 10 ml 匀浆器。处理脾组织时,在冰上放置 10 min 之后再转移,以使血红细胞留在上清中。处理肝或肾组织时,可以马上丢弃上清。 dedecms.com

  4. 在所有的样本中加入 5 ml 新鲜的核缓冲液 A。混合,再次移去上清,然后再加入 5 ml 新鲜的核缓冲液 A 重悬组织块。

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  5. 使用电动组织磨碎机匀浆组织 5~10 次,再手动匀浆 5 次。取少量匀桨混合物加入到 CMF PBS 中,在相差显微镜下观察。观察到的核是灰色的、很圆的小泡。如果仍然有完整的组织或细胞,再进行大约 5 次匀浆,再次观察细胞破碎的量。

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  6. 将轻薄棉布折叠成 8 层,在核缓冲液 A 中事先浸湿,过滤匀浆混合液到置于冰上的 30 ml Corex 管中。戴好手套,拧绞棉布使液体流尽。 织梦好,好织梦

  7. 在 15 ml Corex 管中加入 1:1 核缓冲液 A/核缓冲液 B 作为缓冲层。用以下量的缓冲液 A+B 混合液:肝,1.4 ml;背,1ml;脾,0.6 ml。将勻浆混合液加在缓冲层上。 本文来自织梦

  9. 去上清,沉淀使用如下体积的核缓冲液 B 重悬:肝和肾,11ml; 脾,3.6 ml。先加入 2 ml 核缓冲液 B 轻柔地重悬沉淀成为黏稠的液体,再加入剩余的核缓冲液 B。 织梦好,好织梦

  12. 倒掉上清,将离心管倒置在吸水纸上以去净余液。轻柔地将沉淀重悬于如下体积的核缓冲液 C 中:肝和肾,0.2 ml; 脾:0.25 ml。将同一组织来源的重悬液合并到一个管中,置冰上。

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  14. 每种核重悬液各取 1/5 与等体积的 2×TNESK 溶液混合。充分混合后,37℃ 温育过夜。

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  15. 将剩余的液体在冰上分到以下数目的反应管中:肝和肾,大于 6 个;脾,大约 3个。要经常摇动样品以防止结块。

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  19. 加入等体积的 2×TNESK 溶液终止反应,剧烈摇动管子几次混匀,37℃ 温育过夜。 本文来自织梦



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