欢乐生肖玩法-官网|首页

您所在的位置:主页 > 新闻中心 > 阅读资讯:酶工程第二章产酶微生物的分离和选育

酶工程第二章产酶微生物的分离和选育
[ 来源:未知 | 作者:admin | 时间:2019-9-8 02:01:59 ]

  酶工程第二章产酶微生物的分离和选育_生物学_自然科学_专业资料。酶活力的表示方法 活力单位(active unit) 量度酶催化能力大小 习惯单位(U): 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位(IU): 1μmoL变化量 / 分钟 Katal(Kat):1

本文来自织梦

  酶活力的表示方法 活力单位(active unit) 量度酶催化能力大小 习惯单位(U): 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位(IU): 1μmoL变化量 / 分钟 Katal(Kat):1moL变化量 / 秒 比活力(specific activity) 量度酶纯度 总活力单位 比活力= 总蛋白mg数 = U(或IU) mg蛋白 回收率和纯化倍数 每次总活力 回收率= 第一次总活力 ×100% 每次比活力 纯化倍数= 第一次比活力 E ? S??? ?k1? ? ES ??k2 ? P ? E k ?1 第二章 产酶微生物的分离和选育 教 学 1.1产酶微生物 内 1.2分离和筛选 1.3诱变育种 容 1.4基因育种程育种 1.5原生质体融合育种 1.1 产酶微生物 微生物产酶的优势 1、种类多,产能高,酶种类多样化 2、周期短,繁殖快,培养简单、成本相对低 3、易突变,易选育获得高产菌株 4、易进行基因工程改造 工业生产常用的微生物: 细菌、放线菌、酵母菌、霉菌 · 从自然界中分离出来直接利用; · 对野生菌株进行人工诱变,得到突变株才能利用。 · 使用重组DNA技术改造的菌株 目前育种总趋势: 从野生菌转向变异菌; 自然选育转向代谢育种; 诱发基因突变转向基因重组的定向育种 5 1.1.1 产酶微生物的种类 1、细菌 属原核单细胞生物,有球菌、杆菌和螺旋菌三类, 分革兰氏阳性菌和阴性菌。在发酵专业中常用的是杆菌, 它易形成芽孢。 2、放线菌 属原核生物,菌落呈放射状,广泛存在于泥土中, 最大经济价值是用来生产抗生素。 3、霉菌 属真核生物,俗称丝状真菌。在发酵工业、农业、食品 和皮革等方面有重要用途,但易引起工业原料、产品和农副 产品的发霉变质。 4、酵母菌 属真核单细胞生物,主要生长在偏酸含糖量较高的 环境中,酒精、饮料等生产中有重要用途。 6 ? 细菌(bacteria): 工业生产常用的细菌有 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌(Brevibacterium) 用于生产: 生产淀粉酶(amylase) 蛋白酶(proteinase) 乳酸(lactic acid) 醋酸(acetic acid) 氨基酸(amino acid) 肌苷酸(inosinic acid) 基因工程常用宿主(工程)菌之一。7 ? 放线菌(Actinomycetes) 常用的放线菌主要来自以下几个属:链霉菌属、小单孢 菌属和诺卡氏菌属等。 最大经济价值在于能产生多种抗生素(antibiotics)。 从微生物中发现的抗生素,有60%以上是放线菌产生的,如 链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。 8 ? 酵母菌(yeast) 工业上用的酵母菌有: 啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、 假丝酵母(Candida)、 类酵母(Saccharomycodes)等 用于酿酒(Brewing)、制造面包、 制造低凝固点石油、生产脂肪酶 (lipase),以及生产可食用、 药用和饲料用酵母菌体蛋白等。 基因工程常用宿主(工程)菌之一。 9 ? 霉菌(mould) 工业上常用的霉菌有: 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉,子囊菌纲的红曲霉, 半知菌类的曲霉、青霉等; 产品: 酶制剂(enzyme preparation)、抗生素(antibiotic)、有 机酸(organic acid)及甾体激素(steroid hormone) 等。 10 几 种 菌 落 11 1.1.2 微生物酶的种类 常见酶 ? 蛋白酶 ? 酸性蛋白酶 ? 中性蛋白酶 ? 碱性蛋白酶 ? 糖化酶 ? 淀粉酶 ? 脂肪酶 ? 纤维素酶 医药与分析研究用酶 ? 青霉素酰化酶 ? SOD ? 溶栓酶 ? 透明质酸酶 12 1.1.3 产酶微生物的来源 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 ? 土壤 ? 水体 ? 空气 ? 极端环境 向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取 或购买; 13 菌落数与空气清洁度的关系 空气清洁度 菌落数 最清洁的空气 1 洁净空气 30个以下 普通空气 30-150 轻度污染空气 300以下 严重污染空气 301以上 14 微生物工业对菌种的要求P55 作为大规模生产,对菌种有下列要求: (1)产酶量高、易分离。 (2)易于控制培养条件,酶活性高;发酵周期较短。 (3)非致病菌、不产生任何有害的物质和毒素, (4)菌株稳定、抗杂菌和抗噬菌体能力强。 15 第二节 产酶微生物的分离和筛选 分离思路 ? 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性,采用各种筛选方法, 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 ? 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌,也必 须重新进行分离纯化。 ? 有了优良的菌种,还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。 从自然界筛选 17 新种分离与筛选的步骤(P56) ? 定方案:首先要查阅资料,了解所需菌种的生长培养特性。 ? 采样:有针对性地采集样品。 ? 增殖:人为地通过控制养分或培条件,使所需菌种增殖培养 后,在数量上占优势。 ? 分离:利用分离技术得到纯种。 ? 发酵性能测定:进行生产性能测定。这些特性包括形态、培 养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和 产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提 取工艺等。 (一)样品采集 从大自然中分离筛选新的微生物菌种 纤维素酶:堆积和腐烂纤维素区域,如腐烂树干上; 果胶酶:霉烂果蔬 淀粉酶:酿酒厂、淀粉厂周围土壤、污泥、排水中 蛋白酶:屠宰场、豆制品厂污泥中。 土壤分离为主要来源:~15cm处土壤 19 农田上层 15cm 处微生物的数量 微生物 细菌 放线菌 真菌 藻菌 原生动物 每克土壤中的数量 9.8×107 2.0×106 1.2×105 2.5×104 3.0×104 方法:3~5个取样点、~10g/点,混合后于灭菌纸袋中,标记: 地点、日期、土壤性质、植被情况及pH。 采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。 20 方法 ? 为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的 细菌菌群,特别是分离在唯一微环境区域中出 现的菌群时,必须十分重视样本的采集。 ? 样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样 采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋 和塑料瓶等。 1.土样采集方法 ? 森林、旱地,草地可先掘洞,由土壤下层向 上层顺序采集; ? 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插 入圆筒采集。如果层次要求不严格,可取离 地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入 聚乙烯袋或玻璃瓶中。 2.植物体采集方法 ? 在采集叶面时,一般是用灭菌的剪刀、 打孔器、安全刀片等,由几片新鲜叶片的 同一部位切取一小块,并注意不要损伤周 围边缘。 ? 选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反 面和在一片叶上的取样部位。 ? 采集植物根及根系时,将洗净的根装入采 样袋中。 3.水样采集方法 ? 用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌 的广口塑料瓶中。 ? 由于表层水中含有泥沙,故在采样时应在较深的 静水层中采集水样。 ? 方法是:握住采样瓶底浸入水中30-50cm处,然后 瓶口朝下打开瓶盖,让水样进入。如果有急流存 在的话,应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水 中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装 满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测, 或者4℃下贮存。 (二)增殖培养 为了容易分离到所需的菌种,让无关的微生 物至少是在数量上不要增加,可以通过配制选择 性培养基,选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制,可选定糖,淀粉、 纤维素,或者石油等,以其中的一种为唯一碳源, 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生 长,而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下 阶段的纯种分离就会顺利得多。 富集方法 1、添加特殊的营养物质 2、调整培养基的酸碱性 3、控制培养温度和热处理 4、添加抑制剂 (三)培养分离 ? 尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于 微生物的混杂生长状态。因此还必须分离,纯 化。在这—步,增殖培养的选择性控制条件还 应进一步应用,而且控制得细一点,好一点。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。 11.稀.稀释释平平皿皿分分离离法法 (1)稀 释 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1g 100ml 1/100 9ml 9ml 9ml 1/1000 10-4 10-5 9ml 10-6 9ml 10-7 9ml 10-8 1.稀释平皿分离法 a.倾注平皿分离法 b.涂布平皿分离法 2.平皿划线分离法 a. 连续划线分离法 b. 分区划线分离法 (四)筛 选 ? 这一步是采用与生产 相近的培养基和培养条 件,通过三角瓶的容量 进行小型发酵试验,以 求得适合于工业生产用 菌种。 (五)毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的, 将其作为生产菌种应当十分当心,尤其与食品 工业有关的菌种,更应慎重。据有的国家规定, 微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米 曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外, 其他微生物作为食用,均需通过两年以上的毒 性试验。 优良菌种应具备的特征 ? 对菌种的要求 天然菌种的生产性能较低,一般需要进行选 育。 1.生产力:能在廉价的培养基上迅速生长,所需的代谢产 物的产量高,其它代谢产物少 2.操作性:培养条件简单,发酵易控制,产品易分离 3.稳定性:抗噬菌体能力强,菌种纯,不易变异退化 4.安全性:是非病源菌,不产有害生物活性物质或毒素 优良菌种应具备的特征 ? 选择生产菌种应注意的因素 1.原料方面:广,转化率高; 2.产物方面:目的产物含量高,副产物少; 3.菌体方面:生长快、繁殖力强,耐受力强, 抗污染、抗噬菌体能力强,遗传特性稳定 4. 设备方面:产泡沫少,适宜大罐生产。 (培养条件异,周期短,需氧量小,抗污染能力强) 从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 采 样 增殖培养 纯种分离 纯培养 生产性能测定 方法、地点、时间和周围环境记录 纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落: 1.稀释分离法 2.平板划线分离法 ⑴ 涂菌: ⑵ 划线分离:①分步划线.组织分离法 测定代谢产物或其它目的性状 二、诱变剂和诱变处理 物理诱变剂: 物理因素中目前使用得最方便而且十分有 效的是紫外线。其他的几种射线都是电离性质 的,有一定的穿透力,一般都由专业人员在专 门的设备中使用,否则有一定危险性。 化学诱变剂: 如碱基类似物、烷化剂等。 ps:化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷 化剂。 1. 使用经济方便 2. 专一性 不同药剂对不同植物、组织或细胞、染色体 节段、基因的诱变有一定专一性。 注意:致癌 3. 诱变机制与辐射育种不同 剂 辐射诱变因高能射线造成,染色体结构变异 广泛 化学诱变是化学药剂与遗传物质发生生化反 应,结果多是基因的点突变,所以更为适用 。 三、诱变育种步骤 ?出发菌株的选择 ?处理菌悬液的制备 ?诱变处理 ?筛选 ?保藏 2.制备细胞悬液 要求: ①菌体处于对数生长期,并使细胞处于同步生长; ②细胞分散且为单细胞w,hy以避免表型迟延现象( phenotypic lag); 方法: ①玻璃珠打散10-15min; ②加0.3%吐温80(表面活性剂) ③用无菌脱脂棉过滤。 指某一突变在DNA 复制和细胞分裂后, 才在表型上显示出 来,造成不纯的菌 落。 制备: ①分离性迟延现象 物理诱变剂——生理盐水(0.85%N②a生Cl理) 性迟延现象 化学诱变剂——缓冲液 浓度: 细菌、放线.诱变处理: 诱变剂的作用: ①提高突变的频率 ②扩大产量变异的幅度 ③使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法:不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变 剂的敏感程度不同,所以在诱变处理前,一般应预先 作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线,选择合适 的处理剂量。—致死率是最好的诱变剂相对剂量的表 示方法。 最适剂量的选择:产量性状的育种中多倾向于低剂量(致 死率在70~80%) ? 选择诱变剂的种类:在选用理化因子作诱变剂时,在同样 效果下,应选用最方便的因素;而在同样方便的情况下, 则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中,尤以紫外线 为最方便,而在化学诱变剂中,一般可选用诱变效果最为 显著的“超诱变剂”,如NTG。 ? 简便有效的诱变方法:紫外线的照射最为方便。 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反应的方 法很多,实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易 处理方法的大致操作步骤是:先在平板上涂上出发菌株细 胞,然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒(也 可放吸有诱变剂溶液的滤纸片),经培养后,在制菌圈的 边缘挑取若干突变菌落,分别制成悬浮液,然后将其涂在 一般平板表面使长出许多单菌落,最后可用影印培养法或 逐个检出法选出突变种。 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的 达到初步要求的分离菌落为目的,以量为主。 透明圈法:混浊底物被分解后形成透明圈。如 可溶性淀粉、碳酸钙等。 变色圈法:直接用显色剂或指示剂。 生长圈法:利用某些具有特殊营养要求的微生 物作为工具菌,要分离的微生物能在一般培养条 件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长,形 成生长圈。 抑制圈法:琼脂块培养法。 1、复印技术 2、大通量筛选(琼脂块法) 孢子菌悬液 琼脂平皿 诱变剂 29度,3d 6mm打孔器取出 放入另一平皿 温度,4-5d 17-18h 生物鉴定板 复筛: 则是精选,以质为主,也就是以精确 度为主。因此在具体方法上就有差异.在 数量减少后就要仔细比较参加复筛和再 复筛的菌株,最后才能选得优秀菌株。 在以后的复筛阶段,还应不断结合自然 分离,纯化菌株。 第一轮: 诱变处理 初筛 一个出发菌株→→→选出200个菌株→→→选出50株 (每瓶一株) 复筛 →→→选出5株 (每瓶四株) 40株 第二轮: 40株 诱变处理 初筛 复筛 5个出发菌株→→→ 40株→→ → 选出50株 →→ →选出5株 (每瓶一株) (每瓶四株) 40株 40株 例子: 紫外线的诱变育种 ? 紫外线W紫外线A.灯与处理物的距离为15~30cm,照 射时间依菌种而异,一般为几秒至几十分钟。 一般我们常以细胞的死亡率表示,照射的剂量 死亡率控制在70~80%为宜。 ? 被照射的菌悬液细胞数,细菌为106个/ ml左右,霉菌孢子和酵母细胞为106~107 个/ml。由于紫外线穿透力不强,要求照 射液不要太深,约0.5~1.0cm厚,同时要 用电磁搅拌器或手工进行搅拌,使照射均 匀。 ? 由于紫外线照射后有光复活效应,所以照 射时和照射后的处理应在红灯下进行。 (二)操作步骤 1.将细菌培养液以3000r/min离心5min,倾 去上清液,将菌体打散加入无菌生理盐水再 离心洗涤。 2.将菌悬液放入一已灭菌的,装有玻璃珠的 三角瓶内用手摇动,以打散菌体。将菌液倒 入有定性滤纸的漏斗内过滤,单细胞滤液装 入试管内,一般处于浑浊态的细胞液含细胞 数可达107个/ml左右,作为待处理菌悬液。 3.取2~4m1制备的菌液加到直径9cm培养皿 内,放入一无菌磁力搅拌子,然后置磁力 搅拌器上、15W紫外线cm处。在正式 照射前,应先开紫外线min,让紫外灯 预热,然后开启皿盖正式在搅拌下照射10 ~50s。操作均应在红灯下进行,或用黑 纸包住,避免白炽光。 4.取未照射的制备菌液和照射菌液 各o.5ml进行稀释分离,计数活菌细 胞数。 5.取照射菌液2ml于液体培养基中 (300ml三角瓶内装30ml培养液), 120r/min振荡培养4~6h。 6.取中间培养液稀释分离、培养。 7.挑取菌落进行筛选。 亚硝基胍诱变曲霉菌 ? N—甲基—N-硝基-N-亚 硝 基 胍 (NGN , MNNG 或 TG)对真核或原核微生物都 有强烈的诱变作用。其精确 的作用机制尚不很清楚,认 为是伴随着重氮甲烷的生成 及在酸性条件下生成亚硝酸 ,直接作用于细胞内的 DNA 复 制 系 统 , 从 而 诱 发 了变异。MNNG的诱变作用 随pH的升高而增强。 ? (二)操作步骤 1 . 单 孢 子 悬 液 制 备 取 斜 面 , 加 入 6ml 0.1mol/L pH6.o的磷酸缓冲液,用接种环 刮下孢子,振荡试管,立即通过带滤纸漏 斗过滤,由此制得单孢子悬液,若孢子液 浑浊状,其孢子浓度可达l06个/ml,此为 待处理孢子悬液。 2.MNNG溶液的制备 用分析天平称取2mg ,加入2ml 0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液, 于暗处振荡溶解。 3.诱变处理 吸取MNNG溶液lml,加入到 1m1孢子悬液中,30℃振荡30min,立即稀 释1000倍停止作用,然后以10-2,10-4两个 稀释度分离培养,30℃ 3天后计数。 4.死亡率计算 将未处理的孢子液1ml加入 1ml磷酸缓冲液中,同上逐级稀释分离, 30℃下培养3天。根据处理前后的活孢子数 可计算出死亡率。 5.挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选 . 第四节 基因育种 ? 定义:是运用体外DNA各种操作或修改 手法获得目的基因,再借助于病毒、细 菌质粒或其他载体,将目的基因转移至 新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系 统内进行复制和表达, 或者通过细胞间的相互作用,使一个细 胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而 转移给另—个细胞的方法。 一、步骤 1、获得待克隆的DNA片段(基因); 2、目的基因与载体在体外连接; 3、重组DNA分子导入宿主细胞; 4、筛选、鉴定阳性重组子; 5、重组子的扩增与/或表达。 二、载体系统 (一)载体(Vector)的选择 选择标准: 1、能在适当的宿主细胞中复制; 2、具有多种限制酶的单一切点(即所谓多克隆位点) 以便外源DNA插入; 3、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子; 4、载体分子较小,以便体外基因操作,同时载体DNA 与 宿主DNA便于分离; 5、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动 子、增强子、加尾信号等基因表达元件。 种类:质粒、噬菌体和动植物病毒。 (二)质粒载体(Plasmid) 是存在于细 菌染色体外的小 型环状双链DNA 分子,大小约为 数千碱基对。常 有1 ~ 3个抗药 性基因,以利于 筛选。 抗生素标记: tetr ampr cmr 常用质粒载体: pBR322质粒载体 PstI ScaI Ampr HindIII BamHI SalI pBR322 (4.36 kb) ori ? pBR322质粒是由3个不同来源的部分组成 的:含有氨卡青霉素抗性基因(ampr)、四 环素抗性基因(tetr)和DNA复制起点(ori)。 ? pBR322质粒载体较小,其长度为4363bp。 不仅易于纯化,而且即使携带上一段较大 (6-8kb)的外源DNA片段,操作起来仍 较为便利。 ? pBR322质粒载体具有两种抗生素抗性基因以 用作转化子的选择记号,方便选择。例如, 将外源DNA克隆在Bam H I位点上,将这样 的重组质粒转化到野生型大肠杆菌细胞中, 并涂布在含有氨卡青霉素的选择性培养基平 板上,那么存活下来的菌落都将具有Ampr的 表型,它们也必定是获得了编码有这种抗性 基因的转化子。 ? 具较高的拷贝数,若经过氯霉素扩增,每个 细胞中可累积1000~3000个拷贝,为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。 三、重组DNA中常用的工具酶 ? 包括限制性核酸内切酶、DNA连接酶、 DNA聚合酶、逆转录酶等. 限制性内切酶 ? 切开DNA分子所需 的酶:每一种酶 都有其各自的作 用位点。 ? 常用限制性内切 酶 ? 种类及特性 限制性内切酶的剪切方式 ? 粘性未端:切开后的两段DNA各留下一个 尾,这2个尾的核苷酸顺序完全一样,但 是方向相反。它们之间是互补的,在适 当条件下可以再连接一起。 其它工具酶 ? 聚合酶 T4 DNA ? 修补工具酶 DNA聚合酶I ? 末端加工酶 S1核酸酶 , 碱性磷酸单脂酶 ? 末端转移酶 人工加polyA 或polyT 尾 ? 反转录酶 四、目的基因的获取 一、通过建立基因文库分离靶基因 基因文库包括两类:基因组文库:利用限 制性内切酶。 cDNA:用mRNA反转录成单链DNA,再经DNA 聚合酶的作用产生双链DNA。可去除真核 生物基因中不表达的内含子。 二、化学合成法制备DNA片段 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道 它的遗传密码,再依照密码合成基因。 三、聚合酶链反应法扩增基因片段 对于已知全部或部分核苷酸序列的基 因,可以通过聚合酶链反应(PCR), 以基因组DNA或cDNA模板扩增得到目的基 因片段。 PCR技术 ? 根据需扩增片段的两端设计引物。 ? 使DNA解链(高温),引物结合于基因的 两端(低温),在合适温度下开始合成 (链延长)反应。 ? 特点:需要很少的DNA模板,且能直接从 基因组中得到目的基因。 DNA扩增 PCR反应 ? DNA分子的体外连接 DNA片段的体外连接是重组DNA技术的 关键。DNA连接是由DNA连接酶催化完成 的。 DNA连接酶催化两条双链DNA片段相邻 的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。 在 分 子 克 隆 中 最 有 用 的 的 DNA 连 接 酶 是来自T4噬菌体的DNA 连接酶。 ? T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于: 1、连接具有同源互补粘性末端的DNA片 段; 2、连接双链DNA分子间的平端; 3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人 工接头或适配子。 五、重组DNA导入宿主菌 体外连接的重组DNA分子必须导入 适当的受体细胞中才能大量的复制、 增殖和表达。根据所采用的载体的性 质,将重组DNA分子导入受体可有不 同的方法。 遗传学方法 重组DNA的鉴定 五、载体-宿主系统 ? 载体(vector)是携带外源DNA进入宿主 细胞进行扩增和表达的DNA; ? 一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等 构建的。 宿主细胞必须符合以下条件 1、对载体的复制和扩增没有严格的限制; 2、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA; 3、在重组DNA增殖过程中,不会对它进行修饰; 4、重组缺陷型,不会产生体内重组; 5、容易导入重组DNA分子; 6、符合重组DNA操作的安全标准。 例子 透明颤菌血红蛋白基因在产PHB重组 大肠杆菌中的克隆表达 ? 聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)是一种 深受国际生物工程界重视的新型高分子材料,它最重 要的特性是可生物降解性,因此可望为解决日益严重 的“白色污染”问题带来希望。 ? 透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene, vgb)位于1.4-kb的基因片段上,且此基因片段携带内 启动子。 vgb基因产物,即透明颤菌血红蛋白(Vitreo scilla Hemoglobin,VHb),能够从分子水平上提高细 胞自身对溶氧的利用能力,从而使细胞在贫氧环境中 存活,且可以提高目的产物的产量和收率。 透明颤菌血红蛋白基因在产PHB重组 大肠杆菌中的克隆表达 利用生物技术,对基因片段按照不同的 克隆策略进行基因重组,以构建具有可诱导 裂解破壁和高溶氧利用能力的PHB高产重组 大肠杆菌i),将同时从 发酵和分离两方面降低PHB的生产成本,从 而使PHB的大规模推广和应用成为可能 质粒pBR322-vgb的长度为 5.76kb,vgb基因长度为1.4kb,且 该片段可用限制性核酸内切酶 Hind Ⅲ和Sal Ⅰ从质粒上酶切下 来。酶切温度为37℃,时间为3h 。酶切后的vgb片段用低熔点琼脂 糖凝胶电泳纯化分离并回收。同 样,用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ酶切质粒 pTU14,其酶切位点位于多克隆 位点上。用T4噬菌体DNA连接酶 将vgb基因片段连接到酶切后的质 粒载体pTU14上,得到携带氨苄 青霉素抗性(Apr)的新质粒pTU14vgb。 经过约80h的补料培养,重组菌VG1(pTU14)的菌体浓度 可高达25.9g/L,菌体细胞中的PHB百分含量可高达95%以 上,这是迄今为止报道的利用大肠杆菌生产PHB过程的摇 瓶最高值。对补料培养45h后的重组菌进行超薄切片电镜照 相,进一步证实了PHB可以在菌体细胞中大量积累(见图4) 。 第五节 原生质体育种 ? 原生质体育种技术主要有原生质体融合、 原生质体转化技术,此外尚有原生质体诱变 育种等。 ? 原生质体融合育种是基因重组的一种重要方 法。 ? 原生质体融合作为一种新的基因重组手段是 1978年第三届国际工业微生物遗传学讨论 会上提出来的。 一、原生质体融合育种的特点 (一)杂交频率较高:细胞壁去除后在高渗条件下 形成类似于球形的原生质体。 (二)受接合型或致育型的限制较小:二亲株中任 何一株都可能起受体或供体的作用,因此有利 于不同种属间微生物的杂交。 (三)遗传物质传递更为完整:原生质体融合是二 亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的 过程。 (四)存在着两株以上亲株同时参与融合形成 融合子的可能性。 (五)有可能采用产量性状较高的菌株作融 合亲株。 (六)提高菌株产量的潜力较大。 (七)有助于建立工业微生物转化体系。 二、原生质体融合育种步骤 1.标记菌株的筛选和稳定性验证。 2.原生质体制备。 3.等量原生质体加聚乙二醇促进融合。 4.涂布于再生培养基,再生出菌落。 5.选择性培养基上划线生长,分离验证, 挑取融合子进一步试验、保藏。 6.生产性能筛选。 原生质体融合基本过程示意图 细胞壁 细胞膜 名词 原生质体 细胞壁溶解 原生质体融合 营养细胞 原生质体 原生质体形成 原生质体融合 融合细胞 细胞壁再生 原生质体融合基本过程示意图 三、原生质体融合育种的要点 (一)标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变 育种,筛选出营养缺陷型或/和抗药性菌 株。这里最重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外,在实 验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是 确证融合的成功,可以采用多标记菌种。 (二)原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中 加入细胞壁分解酶,将细胞壁分离剥离, 结果剩下由原生质膜包住的类似球状的细 胞,它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中,制备原生质体主要 采用溶菌酶;酵母和霉菌一般可用蜗牛酶 或纤维素酶等。 4.酶处理温度 5.破壁时的pH值 6.渗透压稳定剂 等渗透压在原生质体制备中,不仅起 到保护原生质体免于膨裂,而且还有助 于酶和底物的结合,渗透压稳定剂多采 用甘露醇,山梨醇,蔗糖等有机物和KCl 和NaCl等无机物。 比较 原理 诱变育种 基因突变 原生质体 细胞融合 基因工程 基因重组 方法 优点 缺点 辐射诱变;激光、化 学物质诱变,太空( 辐射、失重)诱发变 异 能提高变异频率,加 速育种过程,可大幅 度改良某些性状;变 异范围广。 去细胞壁→细胞融 合→培养 →筛选 有目的地培育优良 品种。 提取目的基因→装 入载体→导入受体 细胞→基因表达→ 筛选出符合要求的 新品种 不受种属限制,可 根据人类的需要, 有目的地进行 时间长,需及时发现 2亲本;技术复杂, 技术难度大,生态 优良性状 缺乏定向性 难度大 危机。 碱性蛋白酶洗衣粉 加酶洗衣粉中添加了多种酶制剂,如碱性蛋白酶制剂 和碱性脂肪酶制剂等。这些酶制剂不仅可以有效地清除 衣物上的污渍,而且对人体没有毒害作用,并且这些酶 制剂及其分解产物能够被微生物分解,不会污染环境。 所以,加酶洗衣粉受到了人们的普遍欢迎。 加酶洗衣粉中的碱性蛋白酶制剂可以使奶渍、血 渍等多种蛋白质污垢降解成易溶于水的小分子肽。碱性 蛋白酶的主要产生菌是某些芽孢杆菌。衣物上脂质污垢 的主要成分是甘油三酯。甘油三酯很难被一般洗衣粉中 的表面活性剂乳化,而留在衣物上的甘油三酯容易发生 氧化反应,使纺织品变黄变脆。碱性脂肪酶制剂能将甘 油三酯水解成容易被水冲洗掉的甘油二酯、甘油单酯和 脂肪酸,从而达到清除衣物上脂质污垢的目的。碱性脂 肪酶的主要产生菌是某些青霉。 20世纪80年代,日本的一家公司首先推出含 有碱性纤维素酶制剂的洗衣粉。碱性纤维素酶本身 不能去除衣物上的污垢,它的作用是使纤维的结构 变得蓬松,从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能 够与洗衣粉充分接触,从而达到更好的去污效果。 碱性纤维素酶还能去除棉纺织品表面的浮毛,使洗 涤后的棉纺织品柔软蓬松,织纹清晰,色泽更加鲜 艳,穿着更加舒适。

织梦内容管理系统



收藏本文 打印 打印本文  推荐本文 告诉好友 投稿 投稿邮箱